PRÁCTICA 13: PRUEBAS IDENTIFICACIÓN BACILOS GR-.
KLIGER
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Permite la diferencia de enterobacterias.
FERMENTACIÓN Y UTILIZACIÓN DE GLUCOSA Y LACTOSA.
La fermentación o utilización de hidratos de carbono se produce tanto en condiciones anaerobias(fondo del tubo) como en condiciones aerobias(superficie inclinada, siguiendo varias rutas metabólicas. Algunos microorganismos fermentan glucosa y lactosa, otros fermentan la glucosa y otros no fermentan ni la glucosa ni la lactosa.
PRODUCCIÓN DE GAS
Se observa la producción de gas(CO2 y O2) como producto final del metabolismo de los carbohidratos
LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO
El ácido sulfhídrico generado reacciona con el hierro que contiene el medio formando sulfuro de hierro(SH2), insoluble y de color negro.
MATERIALES:
- Hilo de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Medio Kligler.
PROCEDIMIENTO:
- Preparar medio Kligler, envasar en tubos y dejar solidificar en pico de flauta.
- Sembrar con el hilo de siembra en picadura en el fondo del tubo y a continuación se siembra en estría sobre la superficie del pico de flauta(también con el asa de siembra).
- Incubar 24h a 37ºC.
RESULTADOS:
Se expresa en primer lugar á glucosa, indicando si forma gas, a continuación se expresa la lactosa y por último el SH2.
Glucosa:
A)FERMENTACIÓN DE GLUCOSA:
Fondo del tubo -> amarillo.
Superficie inclinada del tubo -> rojo más intenso.B)FERMENTACIÓN DE GLUCOSA Y LACTOSA:
Fondo del tubo -> amarillo.
Superficie inclinada del tubo -> amarillo.
C) NO FERMENTAN LA GLUCOSA NI LA LACTOSA:
Fondo del tubo -> rojo mas intenso(utilizan peptonas).
Superficie inclinada del tubo -> rojo más intenso(utilizan peptoonas).D) FORMACIÓN DE GAS:
Producción de gas -> aparición de burbujas, grietas en el medio, desplazamiento del fondo del tubo.
No producción de gas -> no aparición de burbujas, no grietas en el medio, no desplazamiento del fondo del tubo.
E) PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO:
Producción de ácido sulfhídrico -> ácido sulfhídrico reacciona con las sales de hierro del medio = SH2(color negro).
No producción de ácido sulfhídrico- >ácido sulfhídrico no reacciona con las sales de hierro del medio = ausencia de color negro.
Kligler ->-/-/-
FOTOGRAFÍAS:
IMVIC
1.INDOL
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Se usa para identificar bacterias que producen la enzima triptofanasa y por tanto son capaces de producir indol a partir del aminoácido triptófano(presente en el medio)
La presencia de indol se visualiza con el reactivo de Kovacs, que provoca la formación de un anillo rojo en el tubo.
MATERIALES:
- Caldo de peptona o triptona.
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Reactivo de Kovacs (Revelador).
PROCEDIMIENTO:
- Preparar un caldo de peptona o triptona.
- Inocular la colonia de la muestra en el tubo con el medio de cultivo.
- Incubar 24 h a 37ºC.
- Añadir un par de gotas de reactivo de Kovacs que al ser menos denso que el caldo de peptona o triptona queda sobre la superficie de éste formando una especie de anillo.
RESULTADOS:
Si el anillo es de color rojo-morado -> reacción +
Si el anillo es de color amarillo -> reacción -
Indol -> -
FOTOGRAFÍAS:
2. ROJO DE METILO
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Estudia la capacidad de las bacterias para metaboliozar la glucosa por la vía de la fermentación ácido-mixta, en la cual se producen ácidos estables, relativamente fuertes uqe bajan el pH del medio hasta 4-5. El descenso de pH se puede detectar añadiendo , al cultivo, un indicador como el rojo de metilo.
MATERIALES.
- Medio líquido de Clark-Lubs.
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Solución alcoholica de rojo de metilo al 0,04%(Revelador).
PROCEDIMIENTO:
- Preparar el medio líquido de Clark-Lubs, envasar en tubos y esterilizar en el autoclave.
- Inocular las colonias bacterianas en el medio líquido.
- Incubar 24h a 37ºC.
- Añadir varias gotas de solución alcoholica de rojo de metilo al 0,04%
RESULTADOS:
Positiva -> color rojo estable/naranja.
Negativa -> amarilla.
Rojo metilo -> +
FOTOGRAFÍAS:
3. VOGES-PROSKAUER
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Estudiar la capacidad de las bacterias para metabolizar la glucosa por la vía de la fermentación butanodiólica, en la cual se forma acetoina, que es un producto intermediario en la producción de butanodiol. La acetoina puede ser detectada añadiendo, al medio, alfa-naftol y KOH al 40% que reaccionaran con este compuesto produciendo un color rojo característico.
MATERIALES:
- Medio líquido de Clark-Lubs.
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Reveladores: alfa-naftol y KOH
PROCEDIMIENTO:
- Preparar el medio líquido de Clark-Lubs, envasar en tubos y esterilizar en el autoclave.
- Inocular las colonias bacterianas en el medio líquido.
- Incubar 24h a 37ºC.
- Añadir unas gotas de alfa-naftol y KOH al 40%. Agitar y observar a los 15'.
RESULTADOS:
Positiva -> Color rojo-fucsia.
Negativa -> no cambia de color.
Voges-Proskauer -> -
FOTOGRAFÍAS:
4. CITRATO
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Determinar la capacidad que tienen algunos microorganismos para usar el citrato como única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la encima citrasa.
MATERIALES:
- Tubo con 'agar citrato de Simmons'
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
PROCEDIMIENTO:
- Preparar el tubo con el medio de cultivo, esterilizar y dejar solidificar en pico de flauta.
- Aembrar con asa de siembra en la superficie inclinada del tubo.
- Incubar 24h a 27ºC.
RESULTADOS.
- Citrato + -> azul.
- Citrato - -> ausencia de cambio de color del medio.
Citrato -> +
FOTOGRAFÍAS:
AGAR UREA
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Se utiliza para diferenciar a los microorganismos capaces de hidrolizar la urea por acción del enzima ureasa.
MATERIALES:
- Tubo con medio sólido 'Agar Urea'.
- Asas de siembra.
- Mechero de alcohol.
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar en la superficie inclinada del medio sólido.
- Incubar los tubos 24h a 37ºC.
RESULTADOS:
- Ureasa positiva -> vira a rosa
- Ureasa negativa -> no se observa cambio de color.
Urea -> -
FOTOGRAFÍAS:
FENILALANINA DESAMINASA/APP
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
El aminoácido fenilalanina, por desaminación oxidativa, se transforma en ácido fenilpirúvico(APP), que es un cetoácido que puede detectarse porque al añadir cloruro férrico, forma un complejo de color verde.
MATERIALES:
- Tubo con medio de cultivo que contiene fenilalanina.
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- Cloriro férrico al 10%(Revelador).
PROCEDIMIENTO:
- Sembrar en pico de flauta.
- Incubar 24 h a 37ºC.
- Añadir 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro férrico.
RESULTADOS:
- Prueba positiva -> color verde intenso.
- Prueba negativa -> no aparece color verdoso.
APP-> -
(Tubo de la derecha)
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CALDO NITRATO
OBJETIVOS Y FUNDAMENTOS:
Algunas bacterias anaerobias o anaerobias facultativas pueden reducir los nitratos a nitritos, por la acción del enzima nitrato reductasa, o en un paso más puede ser reducido hasta gases u otros productos.
El nitrito procedente de la reducción de los nitratos puede detectarse añadiendo un reactivo colorimétrico (alfa-naftil-amina y ácido sulfanílico) que produce color rojo.
MATERIALES:
- Tubo con 'caldo nitrato'.
- Asa de siembra.
- Mechero de alcohol.
- NIT 1-> alfa-naftil-amina
NIT 2 -> ácido sulfanílico.
Zn (Reveladores).
PROCEDIMIENTO:
- Inocular las bacterias en un medio líquido (caldo) conteniendo nitrato potásico.
- Incubar 24h a 37ºC.
- Tras la incubación se le añade el reactivo colorimétrico(NIT 1 y NIT 2) y si aparece color la prueba se considera positiva y se da por finalizada.
- Si no aparece color hay que añadir un agente reductor(Zn) y observar si aparece o no cloro:
RESULTADOS:
Caldo nitrato -> +
FOTOGRAFÍAS:
